Противовирусная активность соков растений и зеленого чая против SARS-CoV-2 и вируса гриппа in vitro

Аннотация

Респираторные вирусы первоначально заражают носоглотку и ротоглотку, где они усиливаются, вызывают симптомы, а также могут передаваться новым хозяевам. Предотвращение первоначального заражения или снижение вирусной нагрузки при заражении может облегчить симптомы, предотвратить распространение в нижние дыхательные пути или передачу другому человеку. Здесь мы проанализировали потенциал продуктов растительного происхождения для инактивации SARS-CoV-2 и вируса гриппа. Мы обнаружили, что сок черноплодной рябины (Aronia melanocarpa), сок граната (Punica granatum) и зеленый чай (Camellia sinensis) обладают вирулицидной активностью против обоих вирусов, что позволяет предположить, что полоскание ротовой полости может снизить вирусную нагрузку в полости рта, тем самым снижая передачу вируса. / p>

Фон

Респираторные вирусы, такие как вирусы гриппа и коронавирусы, представляют значительную угрозу для здоровья людей во всем мире и являются существенным социальным, экономическим бременем и бременем для здравоохранения, примером чего недавно стала пандемия коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2) [ 1 ]. Для SARS-CoV-2 длительный инкубационный период до 14 дней, субклиническое течение и высокая степень передачи до появления симптомов привели к беспрецедентному распространению по всему миру [ 1 , 2 ]. Респираторные вирусы первоначально поражают верхние дыхательные пути, как носоглотку, так и ротоглотку, где они усиливаются, вызывают респираторные симптомы [ 3 ] и распространяется на новые хосты. Недавние исследования показывают, что полоскание горла коммерческими ополаскивателями для полости рта может снизить распространение вируса и потенциально инфицирование [ 4 , 5 ]. Некоторые натуральные продукты также обладают прямой противовирусной активностью или могут облегчать симптомы респираторных инфекций. Гранат ( Punica granatum ) [ 6 ] и черноплодная рябина ( Aronia melanocarpa ) [ 7 ] экстракты показали свою противовирусную активность в отношении вирусов гриппа in vitro , сироп бузины ( Sambucus nigra ) показал улучшение облегчения симптомов у больных гриппом [ 8 ], а метаанализ показал, что полоскание горла зеленым чаем ( Camellia sinensis ) снизила заболеваемость гриппом [ 9 ]. Поэтому натуральные продукты с широким спектром противовирусной активности были бы очень полезны для сокращения распространения респираторных вирусов среди населения, поскольку они недороги и быстро применяются. Здесь мы оценили вирулицидную активность in vitro зеленого чая и травяных соков с перспективным использованием в качестве ополаскивателей для полости рта против оболочечных респираторных вирусов, SARS-CoV-2, вируса гриппа A (IAV) и голого аденовируса. тип 5 (AdV5). Мы обнаружили, что вирус гриппа A очень чувствителен к инактивации всеми тестируемыми веществами. Однако SARS-CoV-2 был менее подвержен влиянию: он инактивирован соком черноплодной рябины и чувствителен к зеленому чаю и гранатовому соку. AdV5 был устойчив к большинству продуктов, но титры вирусов были снижены соком черноплодной рябины. Эти результаты подчеркивают потенциал обычных пищевых продуктов растительного происхождения в плане предотвращения инфекций и заболеваний респираторных вирусов с оболочкой, при этом сок аронии был самым сильнодействующим натуральным продуктом, протестированным в данном документе.

Методы

Травяные вещества

Зеленый чай (Bio-Grüntee Japan Sencha Tee-Gschwendner Nr. 700; pH 4,46) получали путем настаивания 3 г листьев с 0,1 г аскорбиновой кислоты (Sigma Aldrich) в течение 4 минут в 300 мл свежекипяченой воды при легком движении. с последующей фильтрацией. Сохраняли сок черноплодной рябины (Bio-Aronia Direktsaft Fa. Aronia original L2719; pH: 3,69), гранатовый сок (Satower Granatapfelsaft Direktsaft klar; pH: 2,99) и сок бузины (Satower Fliederbeersaft; pH: 4,13) с годностью к употреблению. в холодильнике до использования.

Культура клеток

Клетки Vero E6 (эпителиальная почка Cercopithecus aethiops ) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Gibco), с добавлением 2,5% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS), 100 единиц. / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1x заменимые аминокислоты. Клетки почек собак Madin Darby (MDCK) и клетки A549 (аденокарциномный альвеолярный базальный эпителий человека) выращивали в минимальной необходимой среде с солями Эрла (EMEM; Biochrom AG, Берлин, Германия) с добавлением 1% заменимых аминокислот (Biochrom AG, Берлин , Германия), 10% FCS. Клетки BHK-21 (почки Mesocricetus auratus ) выращивали в среде DMEM (CCPro) с 10% FCS. Для экспериментов клетки засевали в среду, содержащую 2% FCS. Клетки инкубировали при 37 ° C в инкубаторе с увлажнением с 5% CO2.

Тестовые штаммы вирусов и культивирование

Вирус размножали путем инокуляции соответствующих клеток-мишеней и культивирования до тех пор, пока не стал заметен сильный цитопатический эффект. Затем собирали супернатант, центрифугировали для удаления клеточного дебриса, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C в качестве запаса вируса. Модифицированный вирус осповакцины Анкара (предоставлен Институтом гигиены животных и ветеринарного здравоохранения Университета Лейпцига) был пассирован на клетках BHK-21 (предоставленных институтом Фридриха Леффлера), вируса гриппа A A / H1N1 / Brisbane / 59/2007 (Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & amp; Co. KG) на клетках MDCK (ATCC), аденовирусе типа 5, штамме аденоида 75 (любезно предоставленном профессором Sauerbrei, Университет Йены, Йена, Германия), на клетках A549 (ATCC) и SARS-CoV -2 BetaCoV / France / IDF0372 / 2020 (получено через глобальный европейский архив вирусов) на клетках Vero E6 (ATCC).

Анализы на инфекцию

Для определения вирулицидной активности растительных веществ их смешивали с соответствующим вирусом, инкубировали в течение определенного времени контакта при комнатной температуре, а оставшуюся инфекционность определяли титрованием конечной точки инфицированной дозы 50 (TCID50) в тканевой культуре. Этот количественный тест подвески, описанный в EN 14476 [ 10 ], был проведен для Модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), вирус гриппа A (IAV) и аденовирус типа 5 (AdV5) путем инкубации соответствующего вируса с соком аронии, бузины или граната, зеленым чаем или буфером в качестве контроля. Вкратце, эффективность тестируемых продуктов была исследована в виде 80% раствора в присутствии 10% мешающего вещества (5% (мас. / Об.) BSA, фракция V (Sigma Aldrich), 0,4% (мас. / Об)) Муцин бычья Glandula submandibularis. Тип IS (Sigma Aldrich), 5% (мас. / Об.) Дрожжевой экстракт (Sigma Aldrich)). SARS-CoV-2 был проанализирован в 90% продукте. По истечении заданного времени контакта тестовую смесь серийно разбавляли в 10 раз и титровали на 96-микротитровальном планшете, содержащем конфлюэнтный монослой соответствующих клеток-мишеней в шести повторностях, и клетки культивировали до тех пор, пока не стал виден сильный CPE. Клетки, инфицированные IAV, дополнительно иммуноокрашивали. Затем клетки исследовали с помощью светового микроскопа, подсчитывали инфицированные лунки и рассчитывали TCID50 согласно Спирман-Керберу. Если цитотоксичность соединения превышала нижний предел количественного определения (LLOQ), титр корректировали соответствующим образом. Вирулицидную активность определяли по разнице логарифмического титра вируса в контроле за вычетом логарифмического титра вируса, инкубированного с исследуемым веществом.

Результаты

Чтобы оценить вирулицидный потенциал четырех продуктов растительного происхождения, мы провели количественный тест суспензии с использованием MVA (EN 14476 [ 10 ]), который представляет собой устойчивый суррогатный вирус, который используется для валидации вирулицидных дезинфицирующих средств против всех вирусов в оболочке в соответствии с Европейским руководством по регулированию биоцидных продуктов [11 ]. Хотя при инкубации с контрольным буфером снижения вирусного титра не наблюдалось, 5-минутная инкубация с соком черноплодной рябины, соком бузины, гранатовым соком или зеленым чаем привела к снижению инфекционности на 3,17, 0,67, 1,0 или 1,0 log10 соответственно ( Рисунок 1 , Таблица 1 ), что указывает на то, что протестированные продукты в целом активны против вирусов в оболочке. Время инкубации 20 минут было лишь незначительно более сильным, что свидетельствует о быстром действии противовирусного эффекта. Затем мы проанализировали два вируса с респираторной оболочкой, ответственные за «свиной грипп» в 2009/2010 гг. И продолжающуюся пандемию COVID-19, IAV и SARS-CoV-2, соответственно, а также AdV5 в качестве «голого» контрольного вируса. 5-минутная инкубация с соком черноплодной рябины показала наиболее сильную противовирусную активность и инактивировала IAV, SARS-CoV-2, а также AdV5 до 99,99%, 96,98% и 93,23% соответственно ( Рисунок 1 , Таблица 1 ). IAV был наиболее чувствителен ко всем продуктам, а инфекционность снижалась на & gt; 99% соком бузины, гранатовым соком и зеленым чаем. Титры SARS-CoV-2 были снижены примерно на 80% под действием гранатового сока и зеленого чая уже после 1-минутной инкубации, однако на него не повлиял сок бузины, что соответствует результатам, полученным с более устойчивым суррогатным MVA. Голый AdV5 был устойчив к трем из четырех продуктов, однако был восприимчив к соку черноплодной рябины ( Рисунок 1 , Таблица 1 ). Таким образом, IAV очень чувствителен ко всем анализируемым продуктам, тогда как SARS-CoV-2 может быть эффективно инактивирован соком черноплодной рябины и в меньшей степени подвержен влиянию гранатового сока или зеленого чая.

Обсуждение

Мы изучили и сравнили вирулицидную активность четырех натуральных напитков на суррогатном и трех респираторных вирусах и обнаружили, что сок черноплодной рябины, зеленый чай и гранатовый сок снижают инфекционные титры вирусов в оболочке, причем сок черноплодной рябины является наиболее эффективным. Тестируемые пищевые продукты показали наивысшую противовирусную эффективность против IAV, ≥ 4 log10, что соответствует эффективности обычных дезинфицирующих средств. Высокая восприимчивость к IAV (H1N1), который также является представителем гриппа B и других штаммов гриппа в отношении химической стабильности, указывает на низкую устойчивость этого семейства вирусов. SARS-CoV-2 вел себя аналогично европейской модели вируса для вирусов с оболочкой, MVA, и оказался более устойчивым. Тем не менее, сок черноплодной рябины инактивировал> 96% инфекционности, а гранатовый сок и зеленый чай снижали титры, однако, в меньшей степени. Примечательно, что активность против MVA является предпосылкой для подтверждения общих дезинфицирующих свойств химических веществ в соответствии с Европейским химическим агентством [ 11 ] и свидетельствует о широкой активности против всех вирусов в оболочке. Как и ожидалось, аденовирус без оболочки был менее восприимчив к тестируемым продуктам, однако также пострадал от очень сильнодействующего сока черноплодной рябины. Как правило, разница во времени контакта не оказывала сильного влияния на эффективность инактивации, что свидетельствует о быстродействующем противовирусном эффекте.

Противовирусная активность растительных продуктов может быть основана на кислом pH, который может напрямую инактивировать вирусные частицы, или на (поли) фенолах, таких как катехины, дубильные вещества или флавоноиды, которые могут действовать на вирусные и клеточные белки [12 , 13 ]. Например, было показано, что полифенолы граната подавляют вирусы гриппа, воздействуя на поверхностные гликопротеины вириона и вызывая структурное повреждение вириона [ 14 ]. Аналогичным образом, катехины зеленого чая разрушают структуру вириона и галлат эпигаллокатехина агрегируют вирусные частицы для предотвращения их взаимодействия с клетками-мишенями [15 ]. Катехины не только действуют на вирусные частицы, но, кроме того, было показано, что они предотвращают слияние, препятствуя подкислению эндосом и вирусным ферментам. Компьютерное моделирование теафлавин-3,3'-дигаллата показало, что он может предотвратить инфекцию SARS-CoV-2, взаимодействуя с его клеточным рецептором, ферментом, превращающим ангиотензин 2 (ACE2) [13 , 15 ]. Следует отметить, что состав натуральных пищевых продуктов может варьироваться от партии к партии, что может повлиять на их противовирусную эффективность. Тем не менее, композиция различных противовирусных активных компонентов, действующих по разным механизмам, представляет собой мощную смесь, препятствующую вирусной инфекции.

Поскольку репликация вируса, симптомы и передача происходят в носо- и ротоглотке, как можно более раннее снижение титров вируса может представлять собой упреждающую стратегию предотвращения инфекции, распространения, заболевания и распространения. Растительные продукты - это обычные и доступные пищевые продукты, которые можно использовать в качестве удобных «полосканий для рта». Антисептические полоскания для полости рта, содержащие агенты, повреждающие мембраны (например, этанол, хлоргексидин, цетилпиридиния хлорид, перекись водорода и повидон-йод), используются в различных частных или клинических ситуациях для профилактических и терапевтических целей, а также при вирусных инфекциях [< a href = "https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.30.360545v1.full#ref-4"> 4 , 5 ]. В отличие от этих химических препаратов, зеленый чай и травяные соки можно применять чаще, и их можно просто проглотить. Уже было показано, что полоскание горла чаем, чайными экстрактами или растительным соком с последующим употреблением алкоголя снижает частоту возникновения вирусных инфекций гриппа, вирусную нагрузку и симптомы [ 8 , 9 ]. Точно так же противовирусные продукты растительного происхождения, такие как черноплодная рябина [ 7 ] или гранат [ 6 ] сок может быть переведен на «клиническое» использование против вирусов гриппа и SARS-CoV-2.

В случае SARS-CoV-2 вирус может передаваться до появления симптомов, что особенно опасно. Полоскание полости рта и полоскание горла испытанными соками и чаем в значительной степени беспроблемно при долгосрочном использовании и может быть подходящей профилактикой до и после контакта с SARS-CoV-2 во время текущей пандемии COVID-19 для любого человека, но особенно для людей с высоким риском инфекции или тяжелого заболевания, включая медицинских работников, пожилых людей или людей с ослабленным иммунитетом. Кроме того, возможность проглатывания «ополаскивателя для полости рта» практична во многих ситуациях, например, во время полета, поезда или автомобиля, в детских садах или школах, и даже может быть частью здорового питания. Кроме того, было бы полезно снизить риск передачи инфекции в школьных классах и у детей, используя ценные и здоровые продукты питания вместо агрессивных дезинфицирующих средств или препятствующих мер.

Таким образом, употребление сока черноплодной рябины, гранатового сока или зеленого чая может дать возможность свести к минимуму распространение респираторных вирусов в оболочке, облегчить симптомы и потенциально способствовать профилактике заболеваний, и клинические исследования их преимуществ являются оправданными.