Activitatea antivirală a sucurilor de plante și a ceaiului verde împotriva SARS-CoV-2 și a virusului gripal in vitro

Rezumat

Virușii respiratori infectează inițial regiunile nazo și orofaringiene, unde se amplifică, provoacă simptome și pot fi transmise și unor noi gazde. Prevenirea infecției inițiale sau reducerea încărcăturilor virale la infecție pot calma simptomele, pot preveni diseminarea în căile respiratorii inferioare sau transmiterea către următorul individ. Aici am analizat potențialul produselor derivate din plante pentru a inactiva SARS-CoV-2 și virusul gripal. Am constatat că sucul de ardei negru (Aronia melanocarpa), sucul de rodie (Punica granatum) și ceaiul verde (Camellia sinensis) au activitate virucidă împotriva ambilor virusuri, sugerând că clătirea orală poate reduce încărcăturile virale din cavitatea bucală, reducând astfel transmiterea virusului.

Fundal

Virusurile respiratorii, cum ar fi virusurile gripale și coronavirusurile reprezintă o amenințare semnificativă pentru sănătatea globală și reprezintă o povară socială, economică și medicală substanțială, exemplificată recent de pandemia bolii coronavirus 2019 (COVID-19) cauzată de sindromul respirator acut sever (SARS-CoV-2) [ 1 ]. Pentru SARS-CoV-2, perioada lungă de incubație de până la 14 zile, cursul subclinic și transmisibilitatea ridicată înainte de apariția simptomelor au dus la răspândirea fără precedent pe tot globul [ 1 , 2 ]. Virușii respiratori infectează inițial căile respiratorii superioare, atât zonele nazo și orofaringiene, unde se amplifică, cauzează simptome respiratorii [ 3 ] și răspândiți la noi gazde. Studii recente sugerează că gargară cu clătiri orale comerciale poate reduce răspândirea virusului și potențial infecția [ 4 , 5 ]. Mai multe produse naturale au, de asemenea, activitate antivirală directă sau pot ameliora simptomele infecțiilor respiratorii. Rodie ( Punica granatum ) [ 6 ] și chokeberry negru ( Aronia melanocarpa ) [ 7 ] s-a arătat că extractele sunt antivirale active împotriva virușilor gripali in vitro , siropul de soc ( Sambucus nigra ) a prezentat o ameliorare a simptomelor la pacienții cu gripă [ 8 ], și o meta-analiză a arătat că ceaiul verde gâlgâit ( Camellia sinensis ) a scăzut incidența infecțiilor gripale [ 9 ]. Produsele naturale cu o activitate antivirală cu spectru larg ar fi, prin urmare, extrem de utile pentru a reduce răspândirea virușilor respiratori în populație, deoarece acestea sunt ieftine și rapid implementabile. Aici, am evaluat activitatea virucidă in vitro a ceaiului verde și a sucurilor de plante cu utilizare prospectivă ca clătiri orale împotriva virusurilor respiratorii învelite, SARS-CoV-2 și virusul gripal A (IAV) și adenovirusul gol tastați 5 (AdV5). Am constatat că virusul gripal A este extrem de susceptibil la inactivare de către toate substanțele testate. SARS-CoV-2 a fost mai puțin afectat, totuși, inactivat de sucul de ardei gras și sensibil la ceaiul verde și sucul de rodie. AdV5 a fost rezistent la majoritatea produselor, dar titrurile virale au fost reduse de sucul de ardei iute. Aceste descoperiri subliniază potențialul produselor alimentare obișnuite derivate din plante de a contribui la prevenirea infecțiilor și a bolilor cu virus respirator învelit, în care sucul de ardei iute a fost cel mai puternic produs natural testat aici.

Metode

Substanțe din plante

Ceaiul verde (Bio-Grüntee Japan Sencha Tee-Gschwendner Nr. 700; pH 4,46) a fost preparat prin infuzarea a 3 g de frunze cu 0,1 g acid ascorbic (Sigma Aldrich) timp de 4 minute în 300 ml de apă proaspăt fiartă sub o mișcare ușoară , urmată de filtrare. S-au păstrat suc de ardei negru (Bio-Aronia Direktsaft Fa. Aronia original L2719; pH: 3,69), suc de rodie (Satower Granatapfelsaft Direktsaft klar; pH: 2,99) și suc de soc (Satower Fliederbeersaft; pH: 4,13) cu data maximă valabilă înainte la frigider până la utilizare.

Cultura celulară

Celulele Vero E6 ( Cercopithecus aethiops derivate din rinichi epitelial) au fost crescute în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM, Gibco) care a fost suplimentat cu 2,5% ser fetal de vițel (FCS) inactivat termic, 100 unități / ml penicilină, 100 μg / ml streptomicină, 2 mM L-glutamină, 1 mM piruvat de sodiu și 1x aminoacizi neesențiali. Celulele renale canine Madin Darby (MDCK) și celulele A549 (epiteliale bazale alveolare umane adenocarcinomice) au fost cultivate într-un mediu esențial minim cu sărurile Earle (EMEM; Biochrom AG, Berlin, Germania) suplimentate cu 1% aminoacizi neesențiali (Biochrom AG, Berlin , Germania), 10% FCS. Celulele BHK-21 ( Mesocricetus auratus rinichi) au fost crescute în DMEM (CCPro) cu 10% FCS. Pentru experimente, celulele au fost însămânțate în mediu care conține 2% FCS. Celulele au fost incubate la 37 ° C într-un incubator umidificat cu 5% CO2.

Testarea virusului de tulpini și cultivare

Virusul a fost propagat prin inocularea celulelor țintă respective și cultivarea până când a fost vizibil un efect citopatic puternic. Supernatantul a fost apoi recoltat, centrifugat pentru a epuiza resturile celulare, alicotat și depozitat la -80 ° C ca stocuri de virus. Virusul vaccinia modificat Ankara (furnizat de Institutul de igienă animală și sănătate publică veterinară din Universitatea Leipzig) a fost trecut pe celulele BHK-21 (furnizate de institutul Friedrich Löffler), virusul gripei A A / H1N1 / Brisbane / 59/2007 (Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG) pe celule MDCK (ATCC), adenovirus tip 5, tulpină adenoid 75 (furnizate cu amabilitate de Prof. Sauerbrei, Universitatea din Jena, Jena, Germania) pe celule A549 (ATCC) și SARS-CoV -2 BetaCoV / Franța / IDF0372 / 2020 (obținut prin Arhiva Europeană a Virusului la nivel global) pe celulele Vero E6 (ATCC).

Testele de infecție

Pentru a determina activitatea virucidă a substanțelor pe bază de plante, acestea au fost amestecate cu virusul respectiv, incubate pentru un timp de contact specificat la temperatura camerei, iar infectivitatea rămasă determinată de titrarea punctului final al dozei infecțioase de cultură tisulară 50 (TCID50). Acest test de suspensie cantitativă descris în EN 14476 [ 10 ] a fost efectuat pentru Virusul vaccinia modificat Ankara (MVA), virusul gripei A (IAV) și adenovirusul de tip 5 (AdV5) prin incubarea virusului respectiv cu suc de ardei iute, soc sau rodie, ceai verde sau tampon ca martor. Pe scurt, eficacitatea produselor testate a fost examinată ca o soluție de 80% în prezența unei substanțe interferente 10% (5% (greutate / greutate) BSA Fracțiunea V (Sigma Aldrich), 0,4% (greutate / greutate) Mucin bovină Glandula submandibularis Tipul IS (Sigma Aldrich), 5% (greutate / volum) extract de drojdie (Sigma Aldrich)). SARS-CoV-2 a fost analizat în 90% produs. După timpul de contact specificat, amestecul testat a fost diluat în serie de 10 ori și titrat pe o placă de 96 microtitrări conținând un monostrat confluent al celulelor țintă respective în sextuplicate și celulele cultivate până când CPE puternic a fost vizibil. Celulele infectate cu IAV au fost, de asemenea, imunocolorate. Celulele au fost apoi examinate cu un microscop cu lumină, godeurile infectate numărate și TCID50 calculat în conformitate cu Spearman-Kaerber. Dacă citotoxicitatea compusului a reușit limita inferioară de cuantificare (LLOQ), titrul a fost ajustat în consecință. Activitatea virucidă a fost determinată de diferența titrului logaritmic al controlului virusului minus titrul logaritmic al virusului incubat cu substanța de testat.

Rezultate

Pentru a evalua potențialul virucid al patru produse derivate din plante, am efectuat un test cantitativ de suspensie utilizând MVA (EN 14476 [ 10 ]), care este un virus surogat rezilient care este utilizat pentru validarea dezinfectanților virucidi împotriva tuturor virusurilor acoperite în conformitate cu Ghidul european privind Regulamentul privind produsele biocide [11 ]. În timp ce nu s-a observat nicio reducere a titlului viral la incubarea cu tampon de control, incubarea de 5 minute cu suc de ardei iute, suc de rod, suc de rodie sau ceai verde a dat o scădere de 3,17, 0,67, 1,0 sau 1,0 log10 a infectivității, respectiv ( Figura 1 , Tabelul 1 ), indicând faptul că produsele testate sunt, în general, active împotriva virusurilor acoperite. Un timp de incubație de 20 de minute a fost doar puțin mai puternic, sugerând un efect antiviral cu acțiune rapidă. Am analizat apoi cei doi viruși înveliți respiratori responsabili de „gripa porcină” în 2009/2010 și pandemia COVID-19 în curs, IAV și respectiv SARS-CoV-2, precum și AdV5 ca virus de control gol. O incubație de 5 minute cu suc de ardei iute a produs cele mai puternice activități antivirale și a inactivat IAV, SARS-CoV-2 și, de asemenea, AdV5 la 99,99%, 96,98% și respectiv 93,23% ( Figura 1 , Tabelul 1 ). IAV a fost cel mai sensibil la toate produsele, iar infecțiozitatea a fost redusă> 99% de sucul de soc, de rodie și de ceaiul verde. Titrurile SARS-CoV-2 au fost reduse cu aproximativ 80% de suc de rodie și ceai verde deja după incubare de 1 minut, totuși, neafectate de suc de soc, corespunzând rezultatelor obținute cu MVA surogat mai rezistent. AdV5 gol a fost rezistent la trei din patru produse, cu toate acestea, susceptibil la suc de ardei iute ( Figura 1 , Tabelul 1 ). Pe scurt, IAV este extrem de susceptibil la toate produsele analizate, în timp ce SARS-CoV-2 poate fi eficient inactivat de suc de ardei iute la un nivel inferior afectat de suc de rodie sau ceai verde.

Discuție

Am examinat și comparat activitățile virucide a patru băuturi naturale pe un surogat și trei virusuri respiratorii și am constatat că sucul de ardei iute, ceaiul verde și sucul de rodie au redus titrurile infecțioase ale virușilor înfășurați, iar sucul de ardei iute este cel mai eficient. Produsele alimentare testate au prezentat cea mai mare eficacitate antivirală împotriva IAV, cu ≥ 4 log10, care corespunde eficienței dezinfectanților tipici. Sensibilitatea ridicată a IAV (H1N1), care este, de asemenea, un reprezentant al gripei B și a altor tulpini de gripă în ceea ce privește stabilitatea chimică, indică rezistența scăzută a acestei familii de virusuri. SARS-CoV-2 s-a comportat similar cu modelul european de virus pentru virusurile învelite, MVA, și s-a dovedit a fi mai rezistent. Cu toate acestea, sucul de chokeberry a inactivat & 96% infecțiozitatea și sucul de rodie și ceaiul verde au redus titrurile, însă, într-o măsură mai mică. În special, activitatea împotriva MVA este o condiție prealabilă pentru validarea proprietății generale de dezinfectare a substanțelor chimice conform Agenției Europene pentru Produse Chimice [ 11 ] și sugerează o activitate largă împotriva tuturor virusurilor învelite. Așa cum era de așteptat, adenovirusul neînvelit a fost mai puțin susceptibil la produsele testate, însă a fost afectat și de sucul foarte puternic de ardei iute. În general, diferențele de timp de contact nu au avut o influență puternică asupra eficienței inactivării, sugerând un efect antiviral cu acțiune rapidă.

Activitățile antivirale ale produselor vegetale se pot baza pe un pH acid care poate inactiva direct particulele de virus sau prin (poli) fenoli precum catehine, taninuri sau flavonoide care pot acționa asupra proteinelor virale și celulare [12 , 13 ]. De exemplu, s-a arătat că polifenolii de rodie inhibă virusurile gripale acționând asupra glicoproteinelor de la suprafața virionului și provocând daune structurale virionului [ 14 ]. În mod similar, s-a demonstrat că catekinele de ceai verde distrug structura virionului și epigalocatechina galatul agregează particulele de virus pentru a preveni interacțiunea lor cu celulele țintă [15 ]. Catechinele nu acționează numai asupra particulelor de virus, dar s-a demonstrat în plus că previne fuziunea prin interferența cu acidificarea endozomilor și a enzimelor virale. Pentru theaflavin-3,3'-digallat, modelarea computerizată a sugerat că ar putea preveni infecția cu SARS-CoV-2 prin interacțiunea cu enzima de conversie a receptorului său celular angiotensină 2 (ACE2) [13 , 15 ]. De remarcat, compoziția produselor alimentare naturale poate varia între loturi, ceea ce ar putea afecta eficiența antivirală a acestora. Cu toate acestea, compoziția diferitelor componente active antivirale, care acționează prin diferite mecanisme, reprezintă un amestec puternic care interferează cu infecția cu virus.

Deoarece replicarea virală, simptomele și transmiterea apar în zona nazo și orofaringiană, reducerea titrurilor virale cât mai curând posibil ar putea reprezenta o strategie proactivă pentru prevenirea infecției, diseminării, bolii și răspândirii. Produsele din plante sunt preparate alimentare obișnuite și disponibile care ar putea fi aplicate ca „clătiri orale” convenabile. Clătirile orale antiseptice care conțin agenți care afectează membrana (adică etanol, clorhexidină, clorură de cetilpiridiniu, peroxid de hidrogen și povidonă-iod) sunt utilizate în diverse situații private sau clinice în scopuri profilactice și terapeutice și au fost aplicate în continuare în contextul infecțiilor virale [5 ]. Spre deosebire de aceste preparate chimice, ceaiul verde și sucurile din plante pot fi aplicate mai frecvent și pot fi înghițite pur și simplu. Ceaiul de gargară, extractele de ceai sau sucul de plante urmat de băut s-a dovedit deja că reduce incidența infecțiilor cu virus gripal, a încărcăturilor virale și a simptomelor [ 8 , 9 ]. În mod similar, produsele vegetale active antivirale, cum ar fi chokeberry [ 7 ] sau rodie [ Sucul 6 ] ar putea fi tradus în utilizare „clinică” împotriva virusurilor gripale și SARS-CoV-2.

În cazul SARS-CoV-2, virusul poate fi transmis înainte de apariția simptomelor, care este deosebit de perfid. Clătirea orală și gargară cu sucurile și ceaiul testat sunt în mare parte fără probleme în utilizarea pe termen lung și ar putea fi o profilaxie adecvată pre-și post-expunere împotriva SARS-CoV-2 în timpul pandemiei actuale COVID-19 pentru orice persoană, dar mai ales pentru cei cu risc ridicat de infecție sau boală severă, inclusiv lucrători medicali, vârstnici sau imunocompromiși. În plus, posibilitatea de a înghiți „clătirea orală” este practică în multe situații, cum ar fi în timpul unei călătorii cu zborul, trenul sau mașina, în centrele de zi sau în școli și poate face chiar parte dintr-o dietă sănătoasă. În plus, ar fi util să reducem riscul transmiterii în clasele școlare și copiii folosind produse alimentare sănătoase și valoroase din punct de vedere nutrițional în loc de dezinfectanți agresivi sau măsuri obstructive.

Astfel, administrarea de suc de aronie, suc de rodie sau ceai verde poate oferi posibilitatea de a minimiza răspândirea virusurilor respiratorii învelite, de a ușura simptomele și de a contribui potențial la prevenirea bolilor și la investigarea clinică a beneficiilor lor. Este justificată.